本期分享一篇2018年1月3号发表在 Nature 上的一篇文章，文章的题目是： AMD1 mRNA employs ribosome stalling as a mechanism for molecular memory formation。理解这篇文章需要的基本知识有：

• ribo-seq 技术相关知识，以及简单的数据分析流程
• 简单的分子生物学实验，如载体克隆、双荧光报告系统
• 进化生物学中用来衡量正选择与否的$d_N/d_s$检验

本文的主要结论

本文发现在人类的 AMD1 基因中存在的终止密码子的通读(stop codon readthrough)现象可能形成了一种新的控制 AMD1 表达量的方式，即这种readthrough现象使得一条 AMD1 基因的转录本只能翻译出一定数量的蛋白质(具体的模型放在图三讲)，从而在翻译层面达到控制蛋白质水平的目的。

AMD1 基因功能简介

AMD1 基因的全称是腺苷甲硫氨酸脱羧酶，其可以促进腺苷甲硫氨酸(SAM)的脱羧反应。SAM不仅可以为体内的一些多胺类的合成提供氨丙基，同时还是体内重要的甲基化过程的供体。 AMD1 的蛋白产物 AdoMetDC 对胚胎的正常发育和细胞正常生命活动的维持也有重要作用。之前发现了一种 AMD1 转录本进行负反馈调节的机制：在 AMD1 转录本的上游存在一个uORF，核糖体从5’cap开始扫描会首先翻译uORF，而位于其下游的main ORF是否可以翻译起始则与 AdoMetDC 的反应物多胺有关，从而形成了一种负反馈调节的机制。

我认为这篇文章主要发现了一个现象，并且将readthrough与翻译调控联系起来，还是比较新颖的，但我感觉证据提供的不是很充分，本文图少，可以详细分析一下。

Fig1

首先讨论一下图一，作者在ribo-seq数据中用肉眼观察的方法发现了 ADM1 基因在它的stop codon 之后还存在ribosome footprint，也就是Fig.1A中黄色区域标出的部分，更为反常的是在下游一个in-frame的stop codon处还出现了的很高的峰，图中红色的直方图(高度很高)。那么这一部分的核糖体究竟发生了什么呢？作者首先想到的是发生了stop codon 的 readthrough现象，为了验证这一假说作者选用了进化中常用的$d_N/d_s$检验，首先发现这一3’ extension序列的保守性很高，$d_N/d_s$检验也发现这一部分序列存在较弱的purifying selection,然后作者认为这两条是发生了stop codon readthrough的证据，这个地方我认为存在很大问题：

• 序列保守不能说明发生了stop codon readthrough，因为也可能是3’UTR存在的一些调控mRNA稳定性的顺式元件要求其序列保守。
• 同理存在weak purifying selection也不能说明是发生了readthrough。
• 如果是发生了readthrough，那么为什么只在3’ extension 的stop codon 发生了那么多的堆积(存在峰)。
• 我觉得应该看3’ extension 的reads有没有出现三密码子周期性来判断是否发生了readthrough，当然这样唯一的缺陷是无法排除reinitation 还是readthrough，作者做ribo-seq也很熟悉，不知道为什么没做。

Fig1.c 左图是作者构建的各种突变体，熟悉的分子生物学套路，这张图的结果还是提供了不少信息的。之前有报道认为ribosome footprint也可能是由于形成了RNA-binding蛋白复合体，于是作者设计了五个突变体，包括全长的 *AMD1 基因，以及截断的 *AMD1 基因，发现存在RNase敏感的peptidyl-tRNA复合体，我想提出的问题是如果认为图中标红点的条带是在3’extension上进行翻译的核糖体，那么为什么在其他三个变体中没有观察到对应的条带呢？这张图我感觉争议很大，期待有人一起讨论。

综上，我认为图一的证据不能证明 AMD1 的 main stop codon发生了readthrough。

Fig2

Fig2.A作者设计了三个新的变体，但是这个实验结果就更诡异了，不仅没有观察到read-through的产物，就连作为read-through的正对照的突变体的产物还减少了(图中第二泳道变淡的条带)。作者默认把这一现象解释为是由于 AMD1 tail 的翻译所造成的，但是结合我前面举出的论据，之前并没有给出充分的证据表明 AMD1 tail 是上游的核糖体发生了readthrough进而进行翻译的，这一部分的解释保持怀疑态度。

接下来作者也没管这个，紧接着又设计了双荧光报告系统：Fig2.b、Fig2.c。首先在蛋白层面上说明了确实把终止密码子替换成UGG的转录本的确下降了，同时还控制了mRNA水平，这一步是必须的，但是mRNA的变化量要小于蛋白质的变化，说明蛋白质的变化不全是由于mRNA的变化引起的。

影响蛋白量得另外一种可能性是 AdoMetDC 蛋白延长的C-末端可能会导致蛋白的不稳定，于是作者进行了Fig.d的实验，其中MG132是蛋白酶复合体的抑制剂，如果是延长的C-末端导致了蛋白的降解，那么加入MG132后GFP蛋白的含量应当上升，但是图Fig2d-f的结果否定了这种可能，当然作者也不排除存在未知的蛋白降解途径的可能。

另外添加溶酶体抑制剂的实验也排除了溶酶体的影响，Fig2.h-i。

综上，我觉得作者做Fig2这一系列图的基础不稳，保持怀疑态度。

Fig3

我认为作者从Fig.3就开始了扯犊子模式，首先我还是简单介绍一下作者提出的假说，如图Fig3.a所示，在正常的翻译过程中会存在一部分核糖体发生 stop codon readthrough，但是在下游的in-frame stop codon会发生堵塞，长时间无法释放，之后通过的核糖体就会逐渐堆积，当堆积的核糖体到达main stop codon时，这条转录本就无法继续翻译形成蛋白质了。 说到这里 我先说这个假说一个明显和前面矛盾的地方，如果按照这个假说，那Fig1.a中在黄色区域就不单单是出现一个峰了，而是一整片都是峰，这明显矛盾。

在看说是提供这个假说证据的图Fig3.b，这个蛋白的变化和附录里图7mRNA的变化基本上持平的，我认为这就是mRNA稳定性的改变造成的，都下降了两倍左右，实在不能理解。附一张图七：

在质疑一下Fig3.d，为什么这个又不验证mRNA的水平没有变化呢，我楞是没找到对于这三种突变体mRNA水平的检测，做个RT-PCR不接完了吗。

总结

这篇吐槽的比较猛，不过这也是我一家之言，不全然对，目的是为了一起讨论。总的来说，我一开始看到这篇文章觉得这个作者脑洞可真大，好厉害！但读完以后觉得可以争论的地方还是很多，证据有点弱。